先用去离子水将酚和氯化钠溶解，用1N NAOH将pH调至7.5，然后加入琼脂，煮沸溶解。可按每玻璃瓶20ml量进行分装，置室温冷却，凝固，而后置4℃保存。用时，再煮沸溶解，倒入陪替氏培养皿，让其凝固。
配制时，可根据需要量按上述配方配之。
E2．2．2 病毒浓缩
含病毒的鸡胚尿囊液或细胞维持液
↓
1000xg 离心 15min，去沉渣
↓
100000 xg 离心 1h，去上清
↓
浓缩时，一般鸡胚尿囊液用500ul，细胞上清为700ul。
此时在沉淀物中加入350ul TSE溶液，把沉淀物吹匀，收集到1.5ml沉淀管中。
注：病毒浓缩也可用常规的超速离心，甚至可加以纯化，用时可参照上述比例，如500ul尿囊液变为350ul 。
E2．2．3 TSE溶液配制
Tris 2.42g
NaCl 8.77g
EDTA 0.74g
去离子H2O 900ml
溶解后用1N HCl将pH调至7.8，然后用去离子水补至1000ml，消毒或超滤除菌，至4℃保存，待用。
E2．3 实验步骤
E2．3．1 用模具和打孔器，在已凝固的琼脂上打孔，孔径为5mm，孔距为2－5mm。
E2．3．2 每孔加入约50ul的测定血清，同时需有阳性和阴性血清对照孔。
E2．3．3 将加样后琼脂板放入盒中，封好，置室温下孵育，盒中放一小块湿棉花或湿的滤纸，保持湿度。
E2．3．4 结果观察
24－48h后，观察沉淀线，沉淀线清晰度取决于抗原和抗体的浓度。
沉淀线最好在黑背景下进行观察，而光线是在黑背景后面射出。特异的阳性结果，阳性血清与抗原及测定血清与抗原间呈连续的沉淀线。如出现交叉沉淀线，表明测定血清缺乏与阳性血清一致的抗体。如阳性血清与阳性抗原不出现沉淀线或阴性对照抗血清与阳性抗原出现与阳性对照的孔一样的沉淀线，表明实验需重做。
附录F 流感快速诊断方法
（资料附录）
用酶免疫测定来直接查甲型和乙型流感病毒。
下列两种方法一般在15－20分钟内就可观察结果。
F1 Directigen Flu A Kit快速诊断甲型流感病毒。
测定的第一步采集的标本用含溶解细胞的去污剂和粘液溶解剂的提取溶液处理。稀释标本使之成均质，然后，加到滤膜上。病毒抗原结合到膜上。下一步，洗掉非结合物，同时加入IgG来阻断膜被后来加入试剂非特异性结合。加入酶标记的抗流感病毒特异的单抗，反复洗涤后，与两种底物溶液孵育，通过测定结合酶活性来作判断。病毒抗原存在时，在膜上就可见到一个紫色三角形。病毒抗原在膜中央一个小圆区域内作为试验对照。在试剂盒中含有阳性和阴性对照材料。
F1．1 实验材料
F1．1．1 Directigen Flu A Kit
Becton Dickinson，Cat #8560－20
F1．1．2 测定标本
F1．1．3 甲型流感病毒参照抗原
F1．2 实验流程
将加样控制器嵌入检测板
分别将125ul待检样品或DMEM－S细胞培养液加入两个加液管
每个加液管内加8滴（约0.4ml）试剂A以提取抗原
于加液管上加滴头后充分混合样品
将加液管内所有的混合物逐滴加入检测板中央的检测孔
（每个加液器内的样品加一个检测板，注意避免气泡）
快速滴加试剂1， 直至加滴检测孔（冲洗）
待所以液体被吸附后去掉检测板上的加样
控制器
加4滴试剂2（封闭吸附膜以防抗体的非特异性吸附）
待所有液体被吸附后
加4滴试剂3（酶联抗体）
待所有液体被吸附后置室温2min
快速滴加试剂4， 直至加滴检测孔（冲洗）
待所有液体被吸附后
加4滴试剂5（冲洗）
待所有液体被吸附后
加4滴试剂6（底物1）
孔内出现淡黄色
加4滴试剂7（底物2）
置室温5－30min
加4滴试剂8终止反应（柠檬酸）
F1．3 结果分析
阳性：检测板中央可见一紫红色三角型。
阴性：检测板中央可见一紫红色圆点。
不详：检测板中央既无紫红三角型又无紫红色圆点，实验需重复。
F1．4 对照
滤器中央病毒抗原斑点作为实验对照。如果实验完毕不出现任何斑点，表明不是滤器软片就是有的试剂过期了。在试剂盒中含有阳性和阴性对照材料。病毒阳性和阴性标本可存在－20℃条件下，用做以后测定的对照。
F1．5 局限性
标本质量严重影响着测试的敏感性。当用实验室生长的病毒，其测定的水平在无细胞条件下为1000至2000蚀斑形成单位（PFU）或大约20个受感的细胞。因此，采样时必须收集足够量的上皮细胞，阴性结果不能完全排除患者得过甲型流感病毒感染的可能性。因此，阴性只可认为测不出甲型流感病毒。
如果粘液没有效溶解或从标本中去除掉，它能阻碍病毒抗原附着在膜上。这样就会造成假阴性结果。这些标本只能通过非常慢地吸附到膜来加以鉴定或把它们进一步1：4稀释后进行重测定。
在试剂盒中所含的试剂和滤器装置均有不同的有效期，用时需检查一下它们是否已过期。
F2 FLU OIA KIT快速诊断甲、乙型流感病毒
FLU OIA测定包含甲、乙型流感病毒NP蛋白提取和测定。这个光学免疫测定技术是通过分子薄膜光学厚度的物理改变用肉眼直接观察。这种改变是由于抗原和抗体结合到硅晶片的光学表面所造成。当提取的抗原直接放入光学表面，固定在光学表面上的特异抗体就会捕捉抗原。洗涤后，加入底物就会增加分子薄膜的厚度。这种厚度的改变就导致了反射光线方向的改变。同时肉眼所见到的为一种颜色的改变。光学厚度改变造成一种特殊的可见的颜色改变。在金黄色背景下出现紫光斑点为阳性结果。如果标本中不含有抗原，就不会被固定抗体所捕捉。因此，光学厚度维持不变，表面维持原来的金黄色，表明是阴性结果。
F2．1 实验材料
F2．1．1 FLU OIA Kit。 Biostar，Cat # FLU 30
F2．1．2 待检样品
F2．1．3 甲、乙型流感病毒参照毒株
F2．2 实验流程
从冰箱中取出试剂应置室温使之温度变至18℃－30℃。试剂盒打开后，
洗液置室温保存，如果储存冰箱，用时洗液至少置室温2h。
↓
在提取管中加入3滴标本稀释液和2滴试剂2。
↓
患者标本的拭子马上加入提取管。让拭子与溶液充分相混，
以便让液体移至纤维管的顶部。至少停留3min但不超出5min。
↓
当再加入一滴试剂2时，扶着拭子柄让其在提取管的倒面。
然后，用拭子让其与试剂充分相混。让拭子在管壁不断地挤压，
尽量拧干，让液体越多越好，最后拭子弃之。
↓
用干净的吸管吸一滴提取的标本直接置测试表面中心。
至少停留6min，但不超出7min。
↓
用洗液充分洗涤测试表面，但千万要小心，
不能将吸附在测试表面的材料都洗掉。
↓
检查并核实在测定装置盖子上的吸水纸是否是在第一部位置上。
关紧测试装置，停留10sec来去除测试表面残余的湿气。
↓
打开盖，把吸水纸置第二部位置上，在测试表面中央加入一滴底物。
至少停留6min，但不超出7min。
↓
10sec，打开并检查颜色的改变。
F2．3 结果判断
F2．3．1 纯兰色/沿着中央对照点出现强的紫色反应圈为阳性结果。
F2．3．2 不出现任何反应圈，只见中央对照点者为阴性结果。
F2．3．3 如果中央对照不出现，全部实验作废，需重复测定。
F2．4 对照
每次测定必须设抗原对照，测定时在测定表面中央出现一个小兰点/紫色斑点。灭活的乙型流感病毒抗原对照用来调试试剂。无抗原对照的试验结果是不可靠的。
另外阳性和阴性对照也是必须的。阳性对照抗原为灭活的甲型流感病毒。阴性对照抗原为一种蛋白溶液。
F2．5 局限性
结果好坏取决于标本采集的质量，已灭活的病毒也可进行测定；阴性结果不能完全排除其它非流感病毒感染；阴性结果也不能完全排除患者曾得过流感感染，因此，只能解释为查不到甲型或乙型流感病毒；粪便标本不能进行测定。
F3 直接检查呼吸道脱落上皮细胞内病毒特异抗原
F3．1 原理
流感病毒主要感染部位是在呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原和核酸，通过直接检查上皮细胞内病毒特异抗原或核酸即可诊断。检查方法可采用免疫荧光法查病毒抗原，一般于3－4h内即可完成，采用RT－PCR法查病毒核酸24h内也可完成。
F3．2 标本的采集和制片
标本采集最好用负压抽取法收集呼吸道分泌物，尤其脱落的细胞。可将每标本分成两份，一份低温冻存备作病毒分离等。另一份用pH7.2的PBS将粘液吹打散，1500rpm离心15min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗1－2次，末次离心后弃上清，加入适量pH7.2PBS使细胞垂悬，滴加于带圈的玻璃片上，室温干燥，而后冷丙酮固定10min。
F3．3 间接免疫荧光法
F3．3．1 用10%新鲜羊或牛血清封闭标本片，置湿盒中于37℃30min。
F3．3．2 分别加入适当稀释度的抗甲型和乙型流感病毒型特异的单克隆抗体，置湿盒中于37℃1h 。在PBS中洗两次，共10min。
F3．3．3 加适当稀释度的兔抗鼠荧光素结合物，置37℃1h。在PBS中洗三次，共10min，末次用蒸馏水洗一下。
F3．3．4 于荧光显微镜下观察结果。观察到三个以上胞浆内或胞核内荧光阳性即可判为阳性。
注：也可将采集的标本进行核酸提取，然后经RT－PCR进行扩增，能特异扩增出为阳性，不能特异扩增出为阴性。
F4 标本经敏感细胞增殖后查病毒抗原
F4．1 原理
采集标本接种敏感细胞过夜增殖后，将细胞消化分散制成抗原片，再用免疫荧光法或免疫酶染法检查细胞内病毒抗原，也可用RT－PCR对病毒核酸进行扩增和测定。
标本经敏感细胞增殖后查病毒抗原或核酸，虽需第二天方可得出实验结果，但可大大提高检测的敏感性。
F4．2 标本采集同A2。
F4．3 标本接种培养及制片。
标本接种见A5．1，置35℃过夜培育后，倒掉维持液，用消化液（1份0.25%胰酶+4份Versene）将细胞消化下来。用PBS洗一次，然后滴加于带圈的玻璃片上，室温干燥，冷丙酮固定。同法制备未经感染的正常MDCK细胞片即为正常对照细胞。
F4．4 间接免疫荧光法
见F3．3。
F4．5 间接免疫酶染法
F4．5．1 加单克隆抗体同F3．3．2。
F4．6 间接免疫酶染法
F4．6．1 加单克隆抗体同F3．3．2。
F4．6．2 加适当稀释度的羊抗鼠酶标结合物，湿盒中置37℃1h，用PBS洗两次10min。
F4．6．3 加邻苯二胺底物溶液，其配制法为：4mg邻苯二胺+10ml pH5.0磷酸—柠檬酸缓冲液+15ul H2O2。
pH5.0磷酸缓冲液配制法为：先分别配制0.1mol/L柠檬酸和0.1mol/L磷酸氢二钠，然而，分别按24.3ml和25.7ml相混，再加入等容量（50ml）去离子水，混匀即为pH5.0磷酸—柠檬酸缓冲液。
加入底物液3－5min即可观察结果。
F4．6．4 结果观察
于倒置显微镜下观察（观察时细胞要湿，如果细胞已干，可以加入一滴自来水）。观察到棕红色深染细胞，根据观察到此细胞多少，记录为++++，+++，++，+，±，—。以观察到一个加号以上深染细胞判为阳性；有时可观察到单个深染细胞被无色或淡红色细胞所包围，而正常细胞呈无色或淡红色，亦可判为阳性。
F5 逆转录多聚酶链式反应（RT－PCR）对流感诊断和流感病毒株鉴定
RT－PCR为一种很有用的技术，它能测出非常低水平的流感病毒基因组。不管病毒是活还是死的均可进行测定，因此RT－PCR技术，无论在流感诊断，还是监测和研究中均得到广泛应用。如1997年我国香港特区从患者中分离到H5N1毒株，为证实分离的可靠性就曾用该法对储存在冰箱中标本进行测定。又如近来欧美国家为进一步揭开1918年世界性流感大流行毒株之谜。将死于那次流感长期冻埋在白岭海峡的尸体挖出，取出肺，然后用RT－PCR法进行测定，取得了惊人的结果。要想使该法具有敏感性和特异性，引物序列的选择最为重要，其次要设试验对照，严防实验室交叉污染。
虽然，至今甲型流感病毒已发现的血凝素（HA）有15个亚型，神经氨酸酶（NA）有9个亚型，但许多流感病毒基因组序列已弄清。这给特异引物的设计提供了可能，同时还发现所有流感病毒各个RNA节段，其5’和3’末端均具保守性，可根据此特性来合成流感病毒的通用引物（Universal primer）。
