试样中抗生素用甲醇提取，提取液经0.45μm滤膜过滤，用C18柱分离后，用液相色谱-串联质谱仪测定，正离子扫描，离子对定性，峰面积定量。

4　试剂和材料

　　除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为不含有机物的纯水，纯水中干扰物的浓度需低于方法中待测物的检出限。
　　4.1甲醇：农药残留级。
　　4.2乙腈：农药残留级。
　　4.3乙酸铵：分析纯。
　　4.4乙酸：分析纯。
　　4.5标准品：红霉素购自BBI公司 (纯度≥99%)，盐酸四环素购自北京利科生化科贸有限公司(纯度≥99%)，甲硝唑、盐酸金霉素、土霉素二水合物、盐酸米诺环素、头孢拉定均购自SIGMA公司。
　　4.6标准溶液：分别准确称取红霉素、盐酸四环素、甲硝唑、盐酸金霉素、土霉素二水合物、盐酸米诺环素和头孢拉定适量，用甲醇（4.1）配制成1.00mg/mL标准贮备溶液。准确量取上述标准贮备溶液适量，用甲醇稀释配制成浓度为100µg/mL的混合标准中间溶液，将标准中间溶液转移到安瓿瓶中于4C保存。临用前，再根据需要用甲醇配制成不同浓度的标准使用溶液。
　　4.7乙酸铵缓冲溶液(5mmoL/L, pH = 3.34)：称取0.385g乙酸铵，用约900mL纯水溶解，乙酸调pH = 3.34，纯水定容至1000mL。
　　4.8　0.45μm滤膜。

5　仪器

　　5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：HP1100高效液相色谱仪(Agilent) - API 4000质谱仪(Applied Biosystems) ， 电喷雾离子化源(ESIMS， NI/PI模式)。
　　5.2 分析天平：感量0.1mg和0.001g。
　　5.3实验室纯水机：Barnstead纯水机。
　　5.4涡旋振荡器：Scientific Industries 涡流振荡器。
　　5.5 具塞试管：10mL。

6　试样的制备与保存

　　6.1 试样的制备
　　取有代表性样品5g，搅拌均匀，制成实验室样品。
　　6.2 试样保存
　　制备好的试样置于室温保存。

7　测定步骤

　　7.1样品前处理
　　称取0.1~0.2g样品 (精确到0.001 g) ，置于10mL试管中，加入3.00mL甲醇溶液，涡旋振摇使样品分散后，超声振荡10min。静置，吸取上清液经滤膜（4.8）过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

　　7.4 测定
　　7.4.1液相色谱条件
　　a）色谱柱：Waters Atlantis®C18，5μm， 3.9×150mm；
　　b）柱温：25℃；
　　c）流动相：流动相为乙酸铵缓冲溶液（4.7）、甲醇和乙腈，洗脱梯度见表2。
　　d）流速：300μL /min；
　　e）进样量：10µL。
　　表2 分离七种抗生素的洗脱梯度
　　时间(min) 乙酸铵缓冲溶液(%) 甲醇(%) 乙腈(%)
　　0 90.0 5.0 5.0
　　5 70.0 10.0 20.0
　　10 50.0 20.0 30.0
　　17 50.0 20.0 30.0
　　20 90.0 5.0 5.0
　　25 90.0 5.0 5.0

　　7.4.2 质谱条件
　　a）离子化方式：热喷雾电离(TSI)；
　　b）扫描方式：正离子扫描；
　　c）检测方式：多反应监测（MRM）；
　　d）碰撞气(CAD)：11.0 psi；
　　e）气帘气(CUR)：22.0 psi；
　　f）雾化气(GS1)：35.0 psi；
　　g）加热气(GS2)：20.0 psi；
　　h）喷雾电压(IS)：5500V；
　　i）去溶剂温度(TEM)：500C；
　　j）碰撞室射出电压（CXP）：16V
　　k）定性离子对、定量离子对、扫描时间、碰撞气能量和去簇电压，见表3。

　　表3 抗生素的定性离子对、定量离子对、扫描时间、碰撞气能量和去簇电压
　　化合物 定性离子对
　　（m/z） 定量离子对（m/z） 扫描时间
　　Dwell time（ms） 碰撞气能量
　　CE（eV） 去簇电压DP（V）
　　甲硝唑 172.1/128.0 172.1/128.0 100 16.0 25.0
　　金霉素 479.0/444.1/462.2 479.0/444.1 100 20.0 42.0
　　土霉素 461.0/426.2/443.1 461.0/426.2 100 20.0 35.0
　　米诺环素 458.2/441.3 458.2/441.3 100 18.0 45.0
　　红霉素 734.4/158.1/576.5 734.4/158.1 100 22.0 40.0
　　头孢拉定 350.1/305.4/331.1 350.1/305.4 100 18.0 25.0
　　四环素 445.0/410.0/427.2 445.0/410. 100 29.0 25.0

　　7.4.3 液相色谱-串联质谱测定
　　7.4.3.1 定性测定
　　用抗生素的定性离子对（见表3）进行定性。
　　7.4.3.2 定量测定
　　将混合标准中间溶液用甲醇稀释配制成0-800ng/mL的标准使用溶液，在仪器最佳工作条件下，标准使用溶液分别进样，以使用溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用外标法进行定量测定。样品溶液中抗生素的响应值应在标准工作曲线线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，抗生素标准物质液相色谱-串联质谱的多反应监测（MRM）色谱图参见图A.1。
　　7.5 平行试验
　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定，七种抗生素的平行测定相对偏差应小于20%。。
　　7.6 空白试验
　　除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。

8　结果计算

　　样品中抗生素的质量分数可按式（1-1）计算：

　 ρ1×V1
φ=-------………………（1-1）
　1000×m

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